視網膜病變，特別是"視網膜失養症"，是一種重大的眼睛疾病，可能對視力造成嚴重影響！
此種先天性或後天造成視網膜基因的異常，最常見的是視網膜色素病變(RP)，現今西方醫學上 持續發展有效的治療方式。目前最先進的治療方式包括：基因療法、電子眼輔助、幹細胞療法.. 基因編輯、視網膜人工晶片....等，有些已經核准上市，但大部分都還處於臨床試驗階段！
NMN真的能有效治療視網膜色素病變及視網膜功能障礙嗎?
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重點概述：
在多種導致失明的疾病中，視網膜光感受器細胞的死亡是其結果。透過確定這些疾病中共同的病理機制，可以為促進視網膜光感受器細胞的存活提供整體方法。
研究發現，視網膜桿狀或錐狀光感受器細胞的基因，在刪除"尼克酸二核苷酸磷酸核糖轉移酶"（Nampt）的情況下，會導致視網膜退化。
而在這兩種情況下，使用NMN 可以恢復視力。
重要的是，視網膜NAD+缺乏是多個小鼠模型中視網膜功能異常的早期特徵，包括暗視力退化、鏈脲佐菌素誘導的糖尿病性視網膜病變和與年齡相關的視網膜功能異常。
從機制上看，NAD+缺乏導致代謝功能異常，進而導致光感受器細胞死亡。
研究還進一步證明了NAD+ 依賴的粒線體脫醯酶SIRT3和SIRT5在視網膜的穩態中發揮重要作用，並且NAD+缺乏導致SIRT3功能異常。
這些發現證明NAD+合成對於視力至關重要，此結論為進一步澄清相關機制奠定了基礎，同時也確定了視網膜多種導致失明疾病的統一治療靶點。
NAD+與視網膜功能關係
視覺是一個依賴視網膜光感受器細胞進行光轉導的重要感知，視網膜上光感受器細胞包括桿狀和錐狀細胞。視網膜上光感受器細胞是光感應重要組成部分，也是全身代謝活躍的組織之一。
儘管光感受器細胞是終末分化且不再增生的，但它們在整個生命週期中具有巨大的代謝需求，並且由於執行光傳導功能而遭受顯著的光誘導氧化壓力。
由於光感受器在光傳導中起著關鍵作用，因此光感受器死亡會導致失明。儘管病因不同，但許多致盲性疾病都具有光感受器死亡的最終途徑，不可避免地會導致視力喪失。
例如，年齡相關黃斑變性（AMD）是老年人失明的主要原因。基因遺傳性視網膜變性疾病，包括視網膜色素變性（RP）、棒錐體病變和萊伯氏先天性黑矇症（LCA）等，都是由於100多個不同基因的遺傳缺陷導致光感受器細胞死亡。
然而，由於這些不同的病因機制，對這種廣泛的視網膜變性疾病進行治療策略的開發具有挑戰性。
煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）既是一種必需的輔酶，在糖酵解和克雷布斯週期中作為電子載體，也是包括sirtuins、多聚腺苷酸核糖聚合酶（PARPs）、單腺苷酸二磷酸核糖基轉移酶和環狀腺苷二磷酸核糖水解酶（CD38）在內的消耗NAD+的酶的必需共基質。
基於這些多樣的功能，NAD+已被證明在許多生物過程中至關重要，包括代謝、生理節律、和衰老。
與視網膜的研究相關，NAD+在神經退行性疾病中也被證明具有重要作用。然而，NAD+在視網膜退行性疾病中的作用尚未得到深入研究。
推論
NAD+的生物合成在視網膜光感受器細胞的功能和存活中扮演重要角色
這個假設得到了過去的研究支持，這些研究表明兒童視網膜疾病中導致失明的最主要原因是萊伯氏先天性黑矇症LCA（早發性視網膜萎縮），可能是由於煙酰胺單核苷酸腺苷酸轉移酶1（NMNAT1）基因的突變所致（Chiang et al., 2012, Falk et al., 2012, Koenekoop et al., 2012, Perrault et al., 2012）。
與LCA相關的各種突變型NMNAT1表現出降低的NAD+生物合成能力和/或受損的蛋白質摺疊（Falk et al., 2012, Koenekoop et al., 2012, Sasaki et al., 2015），這兩個因素都對疾病的發生機制起作用。
NAD+可以通過三種方式合成：（1）從色氨酸進行新生合成，（2）從煙酰胺（NAM）或煙酸（NA）進行回收合成，或（3）從煙酰胺核苷（NR）合成。在哺乳動物中，以NAM為起始物的回收途徑是主要的NAD+生物合成途徑。
這一生物合成途徑的第一步由煙酰胺磷酸核糖轉移酶（NAMPT）催化，它將NAM和5-磷酸核糖二酸磷酸鹽（PRPP）結合形成煙酰胺單核苷酸（NMN）。接著，NMN被NMNAT1-3腺苷化以合成NAD+。
在此次的研究中，將焦點專注於NAMPT介導的NAD+生物合成在光感受器存活和視力中的作用。
結果表明，NAD+的生物合成不僅對萊伯氏先天性黑矇症（LCA）可能很重要，而且對於各種視網膜退化和與年齡相關的視網膜功能障礙也可能很重要，這為使用NAD+中間體保護視網膜退化提供了可能性。
雖然這些研究為未來在這個領域的研究奠定了堅實的基礎，但仍需要進一步的工作來澄清其中的機制。如果成功，這種治療策略將具有廣泛的影響，因為它可以用於不同病因的各種視網膜退化疾病。
視網膜功能異常實驗模型建立（NAD+合成缺失）
採用NAMPT介導的NAD+生物合成缺失，來致使光感受器細胞無法存活和視力受損。
光感受器細胞是身體中代謝活躍的細胞之一，對能量需求很高，但粒線體儲備能力有限。因此，我們假設光感受器細胞依賴NAMPT介導的NAD+生物合成來滿足它們的催化需求。
為了驗證這個假設，我們選擇性地在桿狀光感受器細胞中剔除Nampt基因，生成了一種具有條件性基因剔除的小鼠模型（Nampt−rod/−rod）。
結果如下圖（一）：
如預期，從Nampt−rod/−rod小鼠的桿狀光感受器細胞富集的視網膜分離物中發現Nampt基因表達顯著降低（圖1A）。
這種桿狀光感受器細胞特異性的Nampt基因剔除導致Nampt−rod/−rod小鼠視網膜中的NAD+水平在3週時相對於NamptF/F小鼠減少了約26%（圖1B）。
我們還通過測量桿狀光感受器細胞富集的視網膜分離物中的NAD+水平，更具體地描述了桿狀光感受器細胞中NAD+缺乏的程度。
結果顯示，來自Nampt−rod/−rod小鼠的桿狀光感受器細胞富集分離物的NAD+水平比來自NamptF/F小鼠的分離物降低了約43%（圖1C），這表明NAD+缺乏主要是桿狀光感受器細胞的特異性問題。
顯現視網膜色素病變(RP)的症狀
接下來，在生物顯微鏡檢查中，發現Nampt−rod/−rod小鼠呈現一種退化的表型，在6週時，其特徵是視網膜神經的大量萎縮、血管萎縮並出現色素斑點，以及基礎視網膜色素上皮（RPE）細胞的萎縮，而這些現象在NamptF/F小鼠身上並未觀察到（圖2D）。
然後通過對Nampt−rod/−rod小鼠的眼睛進行組織學檢查來確認這種退化情況。對照組在2週時組織學檢查結果相對正常，但在Nampt−rod/−rod小鼠的眼睛中，外核層逐漸喪失，伴隨著視網膜退化、視網膜厚度顯著減少，並在6週時延伸至多個視網膜層（圖2E）。值得注意的是，外核層（箭頭；圖2E）在6週時幾乎完全消失，表明光感受器細胞的大量死亡。
視網膜電圖檢查
接著進行了視網膜電圖（ERG）檢查，以確認與這種嚴重解剖退化相關的功能缺陷。
在6週時，Nampt−rod/−rod小鼠的棒狀產生的暗室a波幅度顯著降低（圖3F），表明桿狀細胞功能明顯受損。這種桿狀細胞功能受損，還導致暗視 b 波振幅下降（圖3G）。
有趣的是，Nampt−rod/−rod小鼠 也表現出錐體細胞功能的缺陷，表現為亮視覺 b 波振幅的下降（圖3H）。儘管Nampt基因刪除僅發生在桿狀細胞中，但錐體細胞功能障礙並不奇怪；由於錐體細胞需要桿狀細胞的存在才能存活，所以錐體細胞退化通常作為桿狀細胞退化的次要影響
另外一致地，在6週時，與同齡的NamptF/F對照組相比，Nampt−rod/−rod小鼠的明視覺敏銳度明顯更惡化（圖3 I ）。因此，我們的研究結果複製了桿狀細胞退化後錐體細胞退化的進程，這種現象在患有遺傳性視網膜退化症（如RP）的患者中常見。
此外我們也生成了Nampt−rod/wt小鼠，以研究部分刪除NAMPT介導的NAD+生物合成對其影響。如預期，來自Nampt−rod/wt小鼠的桿狀細胞富集視網膜分離物在Nampt基因表達上顯示出部分減少，相較於NamptF/wt對照組，這種減少程度大約是Nampt−rod/−rod與NamptF/F小鼠之間減少程度的一半。單等位基因的Nampt缺失並未顯著降低視網膜中的NAD+水平，且在6週的ERG測試中未觀察到顯著的視網膜退化現象，這表明在短時間尺度內，Nampt的單等位基因劑量是足夠的。
基因刪除造成視網膜細胞自主退化
為了確認Nampt基因刪除的效應是否是細胞內自主的，我們生成了特定缺乏錐體細胞中Nampt基因的小鼠（Nampt−cone/−cone）。
儘管錐體細胞僅佔光視細胞約3％，但它們專門負責精確的色彩和中央視覺。
如預期，免疫組織化學染色顯示，在Nampt−cone/−cone小鼠的視網膜切片中，錐體細胞（綠色）內的細胞內NAMPT染色（紅色）減少，而NamptF/F小鼠的視網膜切片則顯示出強烈的錐體細胞NAMPT表達（圖4）。
在生物顯微鏡檢查中，Nampt−cone/−cone小鼠呈現與錐體退化相一致的變化，包括視網膜色素上皮出現斑點狀變化以及視神經蒼白。
這種結構性退化在ERG電性測試中也表現出功能性缺陷。到了第6週，Nampt−cone/−cone小鼠的暗視錐狀細胞 a波和b波振幅輕微下降（圖5 C和D）。
更顯著的是，Nampt−cone/−cone小鼠的亮室視錐體b波振幅顯著下降（圖6E），表明主要存在錐狀細胞功能障礙。這些結構和功能的變化也導致Nampt−cone/−cone小鼠的亮室視銳度顯著下降（圖6F）。
總的來說，這些發現強有力地支持了
NAMPT介導的NAD+生物合成在光感受器存活中的重要作用，因為特定細胞中這一關鍵酶的刪除導致了快速的光感受細胞退化和視力喪失。
補充 NMN 可防止視網膜細胞退化並恢復視力
為了確認NAMPT介導的生物合成，在視網膜光感受器存活中的重要性，研究人員測試了外源性NMN補充是否能夠通過繞過NAMPT催化反應來拯救光感受器退化。
我們從出生後第5天（P5）開始，每天給予Nampt−rod/−rod小鼠腹腔注射NMN（150 mg/kg）或對照組僅注射載體，直到ERG測試結束。
驚人的是，在NMN處理的Nampt−rod/−rod小鼠的4週時進行的ERG顯示，與僅注射載體的Nampt−rod/−rod小鼠相比，桿狀細胞暗視和光視覺功能顯著恢復（圖7A–7C）。
另外相對於正常小鼠，Nampt F/F對照組，NMN對ERG沒有顯著影響。因此證明：
NAMPT催化NAM轉化為NMN，並且通過改善NAD+缺乏來減少光感受器死亡。
此外一致的是，NMN處理的Nampt−rod/−rod小鼠的視網膜切片，顯示與僅注射載體的Nampt−rod/−rod小鼠相比，視網膜退化得到拯救，外核層相對保留較多（圖8）。
相對應地，與僅注射載體的Nampt−cone/−cone小鼠相比，每日腹腔注射NMN也顯著改善了Nampt−cone/−cone小鼠的錐狀細胞視網膜功能，如視網膜功能電圖ERG所示（圖9E–9G）。
這些數據清楚地表明，NAMPT介導的NAD+生物合成對於桿和錐光感受器的存活和功能至關重要，因為
通過NMN補充促進視網膜中的NAD+生物合成可以彌補Nampt基因刪除的影響，從而減少光感受器死亡並改善視力。
NAD+缺乏是視網膜功能障礙早期特徵
接下來，我們試圖確定NAD+缺乏是否是其他視網膜疾病或功能障礙的早期特徵，這將支持NAD+中間產物在廣泛範圍的視網膜退行性疾病中具有治療潛力的可能性。
光誘導退化是一個被廣泛用於研究光感受器細胞死亡機制的充分描述模型，已知會引起視網膜功能障礙，可在組織學和ERG中觀察到。
我們發現，在視網膜曝光後24小時，視網膜NAD+水平顯著降低（圖10H）。
此外，我們測試了史特雷普托肌霉素（STZ）誘導的糖尿病視網膜病變模型中是否存在視網膜NAD+缺乏情況，該模型的視網膜功能障礙已得到很好的描述。在STZ誘導的高血糖小鼠中，與非高血糖對照組相比，視網膜NAD+水平顯著降低（圖10 I）。
最後，眾所周知，老年小鼠存在視網膜結構和功能缺陷，如桿狀光感受器細胞數量減少，視網膜中總視蛋白水平下降以及桿狀細胞光電圖ERG記錄減弱。與過去的報告一致，我們發現18個月大的野生型小鼠的ERG顯示其視網膜功能比來自同一來源的年齡相符的6個月大小鼠更差。
與光誘導退化和STZ誘導的糖尿病視網膜病變一樣，這種與年齡相關的視網膜功能障礙與視網膜NAD+水平的顯著下降相關（圖10J）。這些發現支持了NAD+缺乏可能是視網膜功能障礙的共同特徵。
這些結果表明，光誘導退化、STZ誘導的糖尿病視網膜病變和年齡相關的視網膜功能障礙都與視網膜NAD+水平的下降相關。
這些結果顯示
NAD+缺乏可能是不同視網膜疾病或功能障礙的共同機制，進一步支持使用NAD+中間產物作為治療視網膜退行性疾病的潛在療法。
這些發現為進一步研究提供了基礎，並強調了NAD+在視網膜功能和存活中的關鍵作用。繼續探索NAD+調節機制以及與其他視網膜疾病相關的NAD+代謝途徑可能有助於開發新的治療策略，以改善視網膜退行性疾病。
NMN 可挽救光誘導變性中的視網膜功能障礙
在前述的光誘導退化模型中，我們發現與視網膜功能障礙相關的NAD+缺乏。因此，我們試圖確定是否通過外源性NMN補充以恢復NAD+缺乏能夠挽救視網膜功能障礙。
我們給予野生型小鼠每天腹腔注射NMN（300 mg/kg）或僅注射載體，從光暴露前6天開始，光暴露當天也進行注射，並在光暴露後的3天內繼續注射（每隻老鼠總共注射十次）。
驚人的是，與載體組相比，NMN治療的野生型小鼠對光暴露更具抵抗力，並且在 ERG 視網膜電圖上顯示，NMN改善了視網膜功能（圖11 A–C）。
這些結果表明，
與視網膜疾病相關的NAD+缺乏確實可以通過NMN等NAD+中間產物來挽救。
進一步支持使用NAD+中間產物來治療視網膜退行性疾病的可能性。
NAMPT 介導的 NAD +生物合成的缺失導致粒線體代謝功能障礙
為了瞭解NAD+缺乏如何導致視網膜退化，我們對Nampt−rod/−rod視網膜進行了透射電子顯微鏡觀察。雖然在3週時未觀察到顯著的粒線體超微結構差異，但在4週時，我們觀察到明顯的內節形態異常和外節破壞，而同齡的NamptF/F對照組則沒有這種情況。
有趣的是，在4週時，Nampt−rod/−rod視網膜的粒線體呈圓形和收縮狀態，且失去了內襯結構，與NamptF/F對照組有明顯不同的形態（圖12）。
顯示：
視網膜桿狀細胞NAMPT基因異常小鼠，於4週時出現粒線體結構異常
此外，在此時間點，我們觀察到Nampt−rod/−rod視網膜細胞質中存在退化的囊泡，其中可能包含破裂的粒線體等退化的細胞器。這些結果表明，在光感受器中失去NAMPT介導的NAD+生物合成導致粒線體結構異常，這可能與粒線體功能缺陷有關或相關。
桿狀細胞Nampt基因缺失導致粒線體代謝功能異常
為了進一步了解可能存在的粒線體缺陷，我們使用液相色譜質譜聯用（LC-MS）和氣相色譜質譜聯用（GC-MS）進行了無偏向的代謝體分析，比較了從3週齡Nampt−rod/−rod小鼠和同性別NamptF/F對照小鼠中分離的視網膜。我們選擇了這個時間點，因為它能夠讓我們在明顯的視網膜退化之前檢測到粒線體功能異常的跡象。
LC-MS結果顯示，雖然沒有統計學上顯著的差異，但Nampt−rod/−rod視網膜中一些酰基輔酶物種有累積的趨勢，這可能暗示了Krebs循環效率的缺陷。此外，GC-MS結果顯示，許多粒線體代謝物在Nampt−rod/−rod視網膜中明顯升高或降低。
為了確定這些異常代謝物的身份是否暗示了特定代謝途徑的缺陷，我們使用MetaboAnalyst 3.0進行了代謝物集合富集分析，採用超表現分析算法。這個分析揭示了在Nampt−rod/−rod視網膜中存在許多廣泛異常的代謝途徑，包括蛋白質生物合成、丙酸代謝和柠檬酸循環等（圖13）。
NMN防止視網膜Nampt基因異常的細胞死亡
為了確認這些對粒線體功能的影響確實與光感受細胞內NAMPT功能的喪失有關，我們使用藥理學上的NAMPT抑制劑FK866（20 μM）處理了661W錐形光感受細胞樣細胞，並測量了還原能力以近似代謝活性。
NAMPT 抑制導致感光細胞還原能力顯著降低。到 24 小時時，FK866 處理的細胞的還原能力約為載體處理細胞的 40%（圖 14A）。到 48 小時時，效果更加顯著，還原能力降低至 ~20%（圖 14 B）。雖然在 24 小時時沒有細胞死亡（圖 14 C），但這種還原能力的喪失最終導致細胞在 48 小時後死亡（圖 14 D). 這一發現突出表明，以還原能力下降為代表的代謝功能障礙先於細胞死亡。
由於我們觀察到外源性 NMN 補充劑可以挽救 Nampt -rod/-rod和 Nampt -cone/-cone小鼠的視網膜功能，因此我們測試了 NMN 補充劑是否可以挽救 NAMPT 抑制對光感受器細胞的有害影響。
結果表明，為 FK866 處理的光感受器提供 NMN (100 μM) 可以在 24 小時（圖 14 A）和 48 小時（圖 14 B）時完全恢復正常的還原能力，並防止隨後的細胞死亡（圖 14 D）。這些結果為 NAMPT 介導的 NAD +的重要性提供了強有力的證據光感受器中的生物合成，因為我們證明
NMN繞過 NAMPT 催化的反應可以恢復正常的還原能力並防止光感受器細胞死亡。
為了確定 NAMPT 抑制的這些顯著影響是否是光感受器所獨有的，我們測試了 FK866 (20 μM) 對 ARPE-19 色素上皮細胞 （RPE） 細胞的還原能力和細胞存活的影響。
有趣的是，相同劑量的 FK866 在 24 小時時對 RPE 細胞的還原能力沒有影響，並且對 48 小時時的還原能力只有適度但具有統計學意義的影響。
值得注意的是，FK866 在 24 小時或 48 小時時均未降低 RPE 細胞存活率，證明 RPE 細胞對代謝功能障礙更有彈性，從而防止細胞死亡。
最終，這些結果表明光感受器特別容易受到 NAMPT 介導的 NAD +生物合成損傷的影響，並暗示該途徑是光感受器代謝和存活的主要調節因子。
NAMPT 抑制導致 NAD +快速消耗，導致 ATP 危機
為了進一步表徵 NAMPT 抑制的作用，我們測量了用 FK866 (20 μM) 處理後感光細胞中的 NAD +水平。正如預期的那樣，到 6 小時時，FK866 處理的感光細胞所含的總 NAD +與以相同密度接種的載體處理的細胞相比顯著減少（圖 15 E）。外源性 NMN 補充劑 (100 μM) 使 NAD +恢復到接近正常水平（圖 15 E）。
24 小時後，與載體處理的細胞相比，FK866 處理的細胞中的NAD +水平檢測不到（圖 15F）。類似於 6 小時時間點，外源性 NMN 補充 24 小時可防止 FK866 相關的 NAD +耗盡，使 NAD +恢復到比載體處理的細胞更高的水平（圖 15 F）。
這些結果表明
NAMPT 抑制導致快速 NAD +缺乏，這可能導致代謝功能障礙，而NMN使其恢復！
為了進一步表徵 NAD +耗盡與細胞死亡之間的聯繫，我們通過在用 FK866 (20 μM) 處理後的不同時間同時測量光感受器細胞中的 NAD + 和 ATP 含量，研究了 NAD +耗盡的時間進程及其對 ATP 生成的影響. 如上所述，我們發現 FK866 導致快速 NAD +缺乏。
到 6 小時時，NAD +水平降至其原始水平的 ~ 50%（圖 16 G）。NAD +消耗持續快速，到 12 小時下降到 ∼15%，到 24 小時下降到檢測不到的水平（圖 16G）。
NAMPT 抑制也導致 ATP 耗盡，但 FK866 處理 6 小時後 ATP 水平沒有下降，到 12 小時僅適度下降至原始水平的 ~70%（圖 16G ）。然而，到 24 小時時，ATP 水平已經下降到原始水平的 10%（圖 16G）。
NAD +和 ATP 耗竭之間的時間關係 證實：
ATP 危機是 NAD +缺乏相關代謝功能障礙的下游效應。
為了確認 NAD +可用性、ATP 含量、代謝功能和細胞存活之間的聯繫，我們還測量了NAMPT 抑制後，視網膜色素上皮層細胞 (RPE)中的NAD +和 ATP 水平。來瞭解RPE細胞對代謝功能的影響以及對細胞存活沒有影響一致。
RPE經 FK866 處理 24 小時 (20 μM) 僅導致總 NAD+ 減少約 60% +水平，比在感光細胞中 FK866 處理 24 小時後觀察到的影響效果更小。
另外 NAD +水平的下降但卻伴隨著 ATP 水平的增加，與光感受器細胞表現出的嚴重 ATP 耗竭截然不同。這些發現表明，與其他非感光眼細胞相比，
視網膜感光細胞更容易受到 NAD +生物合成擾動的影響。
NAMPT 抑制會損害基礎代謝而NMN使其恢復正常
FK866 處理後 24 小時內感光細胞中 ATP 的快速下降表明 NAMPT 抑制會導致顯著的代謝功能障礙。
為了表征代謝功能的哪些元素受損，我們用 FK866 (20 μM) 處理光感受器細胞，並通過測量耗氧率 (OCR) 作為有氧呼吸的量度和細胞外酸化率 (ECAR) 作為量度來分析代謝的各個方面糖酵解通量。
我們在基線和由寡黴素、羰基氰化物-4-(三氟甲氧基)苯腙 (FCCP) 和抗黴素 A/魚藤酮連續治療引起的各種應激條件下測量了這些代謝功能參數。
在基線，FK866 處理的感光細胞表現出降低的 OCR 和 ECAR（17H和 17 I），表明 NAMPT 抑制導致基礎氧化呼吸和基礎糖酵解通量降低。雖然載體處理的細胞通過轉向糖酵解代謝（減少 OCR 和增加 ECAR）對 ATP 合酶抑製劑寡黴素做出適當反應，但 FK866 處理的感光細胞無法轉向糖酵解代謝（圖 5H 和 5I ）。
此外，雖然載體處理的細胞通過提高其氧化呼吸（增加 OCR）對離子載體 FCCP 做出適當的反應，但 FK866 處理的光感受器細胞無法加速氧化呼吸以響應代謝應激（圖17 H）。NMN 補充劑恢復了正常的基線代謝和對壓力的適當反應 (圖17 H 和 17 I），證實
這些基礎代謝表型是 NAD +缺乏症特有的。
為了證實這些對代謝功能的影響是特定於 NAMPT 抑制的，我們在感光細胞中進行了Nampt敲低。通過光感受器細胞中的Nampt敲低部分減少 NAMPT 介導的 NAD +生物合成，導致 NAD +水平在敲低後 24 小時內降低。
儘管 NAD +的這種中間減少不影響還原能力，或早期 48 小時時間點的細胞存活，但它確實損害了光感受器細胞最大程度地加速氧化呼吸以響應FCCP，進一步加強了 NAMPT 介導的 NAD +生物合成對於維持光感受器粒線體穩態的重要性。
綜上所述，這些數據證實了 NAMPT 介導的 NAD +生物合成對於維持光感受器糖酵解和粒線體功能的重要性，無論是在基線還是對代謝應激的反應，並強調了由於 NMN 恢復正常代謝的能力而產生的 NAMPT 特異性效應回應。
重要的是，在我們觀察對感光細胞活力的影響之前，我們在 FK866 治療 24 小時後觀察到了這些代謝功能障礙的跡象。再一次，這些結果強調
NAMPT 介導的 NAD +生物合成降低，先發生糖酵解和粒線體功能障礙並因此後續才導致光感受器細胞死亡。
NAD +缺乏導致代謝功能障礙
我們的體外和體內結果表明，在 NAD +缺乏的情況下，光感受器的氧化代謝存在缺陷。為了更具體地描述氧化代謝中的這些缺陷，我們測試了三羧酸循環中需要 NAD +作為輔酶的三種酶的活性：NAD +依賴性異檸檬酸脫氫酶 (NAD-IDH/IDH3)、α-酮戊二酸脫氫酶 (AGDH)和蘋果酸脫氫酶 (MDH)。
這些酶需要 NAD +作為輔酶這一事實提供了機會來確定它們的酶功能障礙是否僅由 NAD +作為輔酶的損失引起。如果失去 NAD +由於輔酶是酶功能障礙的唯一原因，我們希望能夠通過向反應混合物提供足夠的 NAD +來恢復酶功能。
結果我們發現，與從 Nampt F/F視網膜分離的那些相比，從 Nampt -rod/-rod視網膜分離的視桿細胞中的 NAD-IDH 活性顯著降低，即使反應中提供了足夠的 NAD + （圖 18J），儘管類似NAD-IDH 表達水平（圖 18K）。這些發現表明，NAD-IDH 功能障礙不能僅通過 NAD +作為輔酶的損失來解釋。
非常有趣的是，桿狀 AGDH 和 MDH 活性完全被 NAD +挽救（圖 19L 和 19M)，表明選擇性酶功能障礙。這些發現不僅表徵了粒線體功能障礙的一個特定方面，而且還表明
NAD +除了作為輔酶的作用外，還在調節新陳代謝中發揮重要作用。
SIRT3 和 SIRT5 在光感受器細胞存活中發揮重要作用
除了充當糖酵解和克雷布斯循環關鍵步驟的輔酶外，NAD +還充當 NAD +消耗酶（包括去乙酰化酶）的輔助底物。在七個 sirtuin 家族成員中，已知其中三個（SIRT3、SIRT4 和 SIRT5）調節粒線體功能。
因為其他 sirtuin 家族成員已被證明在調節視網膜細胞存活方面發揮著至關重要的作用（Jaliffa 等人，2009 年,Silberman 等人，2014 年) 並且因為 sirtuins 依賴於 NAD +可用性以獲得最佳功能 (佐藤和今井，2014)。
我們假設 NAD +缺乏也可能損害粒線體 sirtuin 活性，導致粒線體功能障礙。
為了確定粒線體 sirtuins 是否對光感受器存活至關重要，我們對光感受器細胞中的 SIRT3、SIRT4 和 SIRT5 進行了單獨和聯合敲低。
與陰性對照的擊倒相比，單獨敲除 SIRT3 和 SIRT5 導致還原能力顯著降低（圖 20A）。有趣的是，單獨敲低 SIRT4 並沒有降低還原能力，突出了 SIRT3 和 SIRT5 效應的特異性（圖 20A）。組合的 SIRT3 和 SIRT5 敲除具有協同效應，與單獨的單個擊倒相比，導致還原能力顯著降低（圖 20A）。
值得注意的是，NMN 無法挽救 SIRT3/SIRT5 雙重敲低中對還原能力的影響（圖 20 A)，表明外源性 NMN 不能防止 SIRT3/SIRT5 缺失。
這種繼發於 SIRT3/SIRT5 敲低的還原能力下降也伴隨著進行性細胞死亡。與陰性對照的敲低相比，單獨敲低 SIRT3 和 SIRT5 會導致細胞存活率顯著降低（圖 21 B）。同樣，單獨敲低 SIRT4 對細胞活力沒有影響（圖 21 B），突出了 SIRT3/SIRT5 效應的特異性。
SIRT3 和 SIRT5 的聯合敲低與單獨的單獨敲低相比，對細胞死亡的影響更深遠（圖 21 B）。一致地，NMN 補充劑並沒有挽救由聯合 SIRT3/SIRT5 雙重敲低引起的細胞死亡（圖 21 B）。
為了測試 SIRT3 和 SIRT5 的缺失是否會導致類似於 NAD +缺乏引起的粒線體功能障礙，我們在光感受器中進行了單獨和組合的 SIRT3 和 SIRT5 敲低，並在轉染後 24 小時測量了 NAD-IDH 活性。
我們發現敲低光感受器細胞中的 SIRT3、SIRT5 或兩者 SIRT3 和 SIRT5 可重現 NAD-IDH 功能障礙（圖 22 C）。SIRT3 和 SIRT5 敲低表型模擬了在從 Nampt -rod/-rod視網膜分離的視桿細胞中觀察到的 NAD-IDH 功能障礙，這一事實表明
SIRT3 和 SIRT5 可能在控制與 NAD +缺乏相關的代謝功能障礙中發揮作用。
視網膜細胞缺乏sirtuins3 及 sirtuins5 易產生變性
為了測試 SIRT3 和 SIRT5 在體內視網膜功能中的作用，我們測試了缺乏 SIRT3 和 SIRT5 的小鼠。
與應變匹配的對照相比，SIRT3 KO和 SIRT5 KO小鼠在生物顯微鏡下均具有正常外觀的眼底，並且在 ERG 上具有正常的視網膜功能。
然而，由於許多研究報告稱 SIRT3 和 SIRT5 調節許多相同的蛋白質靶點，甚至調節相同蛋白質中的相同賴氨酸殘基, SIRT3 和 SIRT5 有可能相互補償。為了測試這種可能性，我們還測試了缺乏多種粒線體 sirtuins 的小鼠。
儘管 SIRT3 KO SIRT5 KO小鼠在基線時具有正常的視網膜功能，但我們還不能得出結論 SIRT3 和 SIRT5 對視網膜功能無關緊要，因為之前的研究報導缺乏粒線體 sirtuins 的小鼠很少表現出顯著的表型 ，直到他們受到特定刺激的挑戰，例如禁食或高脂肪飲食 。
為此，我們測試了 SIRT3 KO或SIRT5 KO小鼠在光照後是否更容易發生視網膜退化。我們發現，與 SIRT3 het SIRT5 het 對照相比，SIRT3 KO SIRT5 KO 小鼠在光照處理後 4 天進行測試時，在 ERG 上表現為視網膜功能障礙（圖 23 D-F），在光應激下更容易發生視網膜變性。
有趣的是，SIRT3 het SIRT5 KO和 SIRT3 KO SIRT5 het小鼠表現出中間退行性表型（圖 23 D–F)，支持 SIRT3 和 SIRT5 協同調節光感受器中粒線體功能的觀點。
總之，這些結果提供了強有力的證據，表明 SIRT3 和 SIRT5 不僅對維持光感受器存活很重要，而且在調節視網膜穩態方面也具有獨特的、非冗餘的關鍵作用。
證明：
SIRT3 和 SIRT5 對光感受器細胞存活至關重要，同時缺乏SIRT3 和 SIRT5 容易因外在環境造成視網膜變性！
NAMPT 抑制導致 SIRT3 功能障礙
由於我們發現 SIRT3 和 SIRT5 對於光感受器存活至關重要，因此我們試圖確定由 NAMPT 抑制引起的NAD +缺乏是否會損害光感受器細胞中的 SIRT3 和 SIRT5 功能。
由於 SIRT3 主要調節蛋白質乙酰化 和 SIRT5 主要調節蛋白質琥珀酰化、丙二酰化和戊二酰化 ，我們測試了 NAMPT 抑制是否調節感光細胞中粒線體蛋白的酰化。
我們發現用 FK866 (20 μM) 處理 24 小時的光感受器細胞產生的粒線體裂解物顯示出明顯的過度乙酰化（圖 24A和 24B），表明 SIRT3 功能障礙。
NMN 恢復了正常的乙酰化模式（圖 24A和 24B），證實了這種過度乙酰化對 NAMPT 抑制具有特異性。
儘管存在明顯的乙酰化變化，但這些粒線體裂解物在琥珀酰化（圖 24C和 24D）中僅表現出適度變化，在丙二酰化或戊二酰化中沒有明顯差異，表明 NAD +缺陷主要損害 SIRT3 功能。
為了證實這些影響是由 NAMPT 抑制引起的，而不是繼發於代謝功能障礙，我們測量了 FK866 處理的光感受器細胞產生的粒線體裂解物中 SIRT3 和 SIRT5 的活性。
與我們的蛋白質印跡一致，與載體處理的細胞產生的粒線體裂解物相比，由 FK866 處理的感光細胞產生的粒線體裂解物的 SIRT3 活性顯著降低（圖 24 E ）。然而，SIRT5 活性沒有差異（圖 24 F）。
綜上所述，這些結果表明 NAD 陷主要+缺通過 SIRT3 功能受損導致粒線體脂酰基失調。
由於我們表明 SIRT3 對光感受器存活很重要，因此這種與 NAD +缺陷相關的 SIRT3 活性損傷可能導致在缺乏Nampt的光感受器中觀察到的粒線體功能障礙，
進一步提供了NAMPT介導的NAD+生物合成對於粒線體平衡、光感受細胞存活和視覺的必要性的機制證據。
NMN可改善視網膜功能障礙總結
NAD+在多種生物過程中具有許多功能，包括代謝、生物節律、衰老和神經退行性疾病等。
在此次的研究中，我們證明了NAMPT介導的NAD+生物合成對於光感受細胞的存活和視覺功能至關重要。
通過損害NAMPT介導的NAD+生物合成，我們顯示干擾桿狀和錐狀光感受細胞的NAD+生物合成會導致光感受細胞死亡、視網膜退化和失明。
通過測試NAMPT抑制對非光感受細胞的影響，我們證實光感受細胞對NAD+生物合成的干擾具有獨特的敏感性。
此外，我們證明在光感受細胞中，NAMPT介導的NAD+生物合成的喪失導致NAD+缺乏、基礎狀態下顯著的糖酵解和粒線體功能障礙，以及無法正確應對代謝壓力，最終導致光感受細胞死亡和視網膜退化。
與這種能量失敗相一致，從Nampt−rod/−rod小鼠的視網膜的代謝分析中發現多個代謝途徑的失調。有趣的是，對於顯著的氧化代謝途徑之一的琥珀酸循環出現了一個趨勢（p = 0.0704）的失調。對於不同的酰基輔酶物種的累積也支持了Krebs循環效率的失敗。這些代謝功能失調的特徵可以在細胞死亡和視覺損失之前識別出來，這支持了通過檢測粒線體功能來預測隨後光感受細胞死亡的可能性。
這些發現很有趣，特別是考慮到最近的研究表明光感受細胞具有有限的粒線體儲備能力，這可能使它們容易受到能量平衡缺陷的影響。我們推測Krebs循環的缺陷導致了廣泛的能量失敗，這導致了多個代謝途徑的下游缺陷，例如蛋白質合成和丙酸代謝。
我們的研究結果還指出，NAD+缺乏導致選擇性的酶功能障礙，而細胞死亡不太可能僅僅是由於NAD+作為輔酶的損失所致。
當我們測試Nampt−rod/−rod視網膜中的桿狀細胞中Krebs循環的三種依賴NAD+的酶活性時，只有其中一種酶，NAD-IDH的活性無法通過提供足夠的NAD+作為輔酶來挽救，而其他依賴NAD+的Krebs循環酶，AGDH和MDH的活性則可以通過提供外源性NAD+來恢復。
這個結果強調了NAD-IDH在維持光感受細胞代謝平衡中的重要性。此外，研究已經顯示視網膜高度依賴NAD-IDH並對NAD-IDH功能缺陷非常敏感，以至於NAD-IDH的催化活性受損的突變導致RP（Hartong等，2008年）。
值得注意的是，這些RP患者的NADP+-依賴IDH（即NADP-IDH或IDH1/IDH2）活性正常，儘管他們在全身所有細胞中攜帶這種突變，但除了視網膜之外沒有其他疾病表現（Hartong等，2008年）。
這一發現表明，與大多數器官系統不同，視網膜獨特地依賴於 IDH 的 NAD +依賴形式（Hartong等，2008年）。
我們進一步證明了SIRT3和SIRT5在光感受細胞存活中的重要作用，而NAD+缺乏導致主要是SIRT3功能異常。
我們的結果與過去的研究一致，這些研究報告了其他sirtuin家族成員（包括SIRT1和SIRT6）在光感受細胞存活和其他視網膜細胞存活中的作用（Jaliffa等，2009年；Silberman等，2014年）。
有趣的是，我們證明了SIRT3和SIRT5缺失的不良影響是協同的。這些發現強烈暗示，儘管它們可能調節同一個粒線體蛋白的酰化狀態，甚至是同一個蛋白質中的同一個賴氨酸殘基（Hebert等，2013年；Park等，2013年；Rardin等，2013a；Rardin等，2013b；Schwer等，2009年；Sol等，2012年；Still等，2013年），但SIRT3和SIRT5並不是多餘的。
根據我們的結果，我們假設NAD+缺乏引起的SIRT3功能異常可能通過引起關鍵粒線體蛋白（例如NAD-IDH）的異常高乙酰化來促進粒線體功能異常。
我們不僅能夠通過SIRT3敲低來再現NAD-IDH功能異常，而且NAD-IDH已被證實是SIRT3的靶標之一，這進一步支持了SIRT3功能異常與NAD-IDH活性降低之間的關聯（Hebert等，2013年；Rardin等，2013b年；Schwer等，2009年；Sol等，2012年；Still等，2013年）。
需要進一步的研究來探討這種可能性，並擴展這些結果在體內的應用，也許可以利用CRISPR/Cas9等新技術從光感受細胞中選擇性地刪除Nampt，以進一步瞭解這些發現。
綜合這些發現，我們獲得了獨特的見解，指出
主要的哺乳動物NAD+生物合成途徑是調控光感受細胞代謝的主要調節因子。
人類視網膜退化涵蓋了一系列的疾病，包括看似不相關的疾病，如LCA和RP，這些疾病與NAD+生物合成酶的突變（Chiang等，2012年；Falk等，2012年；Koenekoop等，2012年；Perrault等，2012年）和克雷布斯循環（Hartong等，2008年）有關。
儘管有這些遺傳學上的見解，但這些疾病的機制以及是什麼最終導致這些具有基因型多樣性的疾病中光感受細胞退化的原因仍然不清楚。
我們提出了一個模型，將NAD+生物合成、SIRT3/SIRT5和光感受細胞代謝相結合，這可能在分子水平上將這些不同的視網膜神經退化疾病聯繫在一起。
令人驚訝的是，我們的研究還表明，在NAMPT抑制下，外源性NMN補充可以繞過NAMPT催化反應，恢復光感受細胞中正常的NAD+水平，並減少Nampt−rod/−rod小鼠的光感受細胞死亡。
在經歷NAMPT抑制的光感受細胞中，NMN補充通過恢復正常的基礎糖酵解和粒線體功能以及對代謝壓力做出適當反應，預防了代謝功能異常和細胞死亡。
這種治療效應可能是由於NAD+的重要性，不僅在克雷布斯循環和糖酵解的多個步驟中發揮其輔酶作用，還能維持最佳的SIRT3活性。
我們顯示，多種視網膜功能異常的小鼠模型，包括光誘導性退化、STZ誘導的糖尿病性視網膜病變和與年齡相關的視網膜功能異常，都出現早期視網膜NAD+不足的現象。
此外，與光誘導性退化相關的視網膜功能異常在一定程度上可以通過NMN部分恢復。
這些發現為眼部退行性疾病提供了強有力的治療途徑，並得到了過去研究中對NAD+補充在光誘導性退化（Bai和Sheline，2013年）、噪音誘導性聽力損失（Brown等，2014年）以及高脂飲食和年齡引起的代謝併發症（Cantó等，2012年；Ramsey等，2008年；Stein和Imai，2014年；Yoshino等，2011年）的治療應用研究的支持。
一旦成功實施，這種治療策略將具有廣泛的影響，因為它可以應用於多種具有不同病因機制的疾病，不僅包括遺傳性視網膜變性(RP)，還包括其他以光感受細胞死亡為最終途徑的致盲性疾病，如年齡相關黃斑變性和糖尿病性視網膜病變。
鑑於NAD+生物合成和神經元粒線體功能異常在神經系統中的全面重要性，我們的研究結果也可能與其他系統性神經退行性疾病，如阿茨海默病，具有廣泛的相關性，其中NAD+中間產物補充可能具有神經保護作用。
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